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plasmid DNA 추출 보고서

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작성일17-11-24 10:49

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실험결과/기타


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설명

plasmid DNA 추출

1. 서론

분자생물학의 도움으로 생물체 내의 여러 가지 생화학적 반응의 조절과 질병의 치료에 대한 이해가 분자적 수준에서 이루어지고 있다 DNA의 생물체 내에서의 이러한 작용이 밝혀짐에 따라 그 중요성이 더욱 부각되었고, 이 DNA를 연구하는 분자생물학은 좀 더 나은 결과를 위해서 함께 발전해 왔다. 예컨대, 인슐린의 대량생산을 위한 Escherichia Coli 의 cloning vector로의 활용은 대단히 많은 당뇨병 환자들을 도왔으며, 유전자의 발현 기작까지도 이 분자생물학의 발달에 의해서 가능하게 되었다. 우리는 분자생물학을 이해하기 위해 DNA를 다루는 기본적인 기술들을 이번 실험에서 익혔다. Escherichia Coli 와 Pseudomonas Fluorescence의 chromosomal DNA를 추출하고, E.Coli 의 Plasmid를 추출해서 제한효소 처리를 통해 plasmid 상태를 확인함으로써 DNA를 다루는 방법을 익혔다.

Chromosomal DNA Extraction
세균으로부터 DNA를 추출하는 방법이다. 세균에 SDS(세제)를 가하고 온도를 높이면 세균의 세포벽에 붙어 있던 인지질이 용해되어 DNA를 세포로부터 해리시킨다. DNA용액에 에탄올을 가하면 DNA는 알코올에 대해 불용성이므로 용액 속에 하얀 실처럼 보이는 DNA가 나타난다.

Restriction Enzyme
DNA는 효소를 이용해서 자르고 붙일 수 있는데, 이 때 DNA의 특정 sequence 인식하여 자르는 효소를 제한효소라 한다. DNA를 자른다는 것은 nucleotide들이 연결되어 있는 phosphodiester 결합을 끊어내는 것을 의미하는데, 이런 역할을 하는 효소를 nuclease라고 하며 바깥쪽을 자르는가 안쪽을 자르는가에 따라서 각각 exonuclease, endonuclease라고 부른다. Endonuclease의 대표적인 것이 바로 제한효소(restriction enzyme, restrict…(생략(省略)) ion endonuclease)이며, DNA에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한다. 제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어오는 바이러스와 같은 외부 DNA를 제거하기 위한 방어기전으로 가지고 있는 것이며, 자신의 DNA는 절단부위의 염기(adenine, cytosine)를 methylation시켜서 자신의 제한효소가 자신의 DNA를 자를 수 없게 보호하고 있다

Electrophoresis
DNA 젤 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 기본골격에 있는 인산기때문에 (-) 전하를 띤다. 이것을 이용해서 젤 전기영동 장치에 50V~100V정도의 전압을 걸어주면 전류가 흐르면서 DNA가 두 전극 사이에 위치했을 때 (+)극 쪽으로 움직이게 된다된다. 이 때 DNA 분자가 젤 matrix 사이를 통과하는 속도는 분자량이 커질수록, 젤의 밀도가 클수록 늦어진다. 또한 DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. Ethidium Bromide(EtBr)는 DNA 이중나선 사이에 들어가서 염기의 역할을 할 수 있다 따라서 인간의 DNA가 치명적으로 손상을 받을 수 있는데, 추출한 DNA에 삽입시켜서 자외선을 비추었을 때 형광을 발하므로 젤 상에서 DNA의 위치를 파악하는데 이용된다된다.

2. 실험목적
plasmid DNA를 추출하여 전기영동으로 관찰할 수 있다

3. 실험재료
원심분리기, pipet, Buffer ①,②,③,④,⑤ , 튜브, collection tube, E.coli

4. 실험방법
◆ 세포의 배양
1) 신선한 LB agar plate에서 single colony를 따서 LB+amp 액체배지 10㎖에 접종한다.
2) 균주 최적온도(37℃)에서 saturation 될 때까지 12시간 이상 배양한다.(대개 overnight).

◆ Plasmid DNA mini prep. protocol
1) E.co

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